Università degli studi di Pavia
Contenuto della pagina
Cerutti attività di ricerca
Studio della funzione centromerica e della complessa architettura cromatinica dei centromeri di mammifero utilizzando come sistema modello le specie del genere Equus (cavalli, asini, zebre).
L’attività di ricerca del mio Dottorato di ricerca verterà sullo studio della funzione centromerica e della complessa architettura cromatinica dei centromeri di mammifero utilizzando come sistema modello le specie del genere Equus (cavalli, asini, zebre).
Il centromero è il locus genico necessario per la fedele ripartizione cromosomica durante i processi di divisione cellulare. Come atteso dalla sua funzionale conservazione tra gli organismi eucariotici, le proteine del centromero/cinetocore condividono generalmente una sostanziale omologia, persino fra organismi evolutivamente non imparentati. Al contrario, le sequenze di DNA centromerico sono altamente variabili in dimensione e complessità. Questo paradosso suggerisce che il centromero sia in effetti un struttura epigenetica, non strettamente dipendente dalla sequenza di DNA. L’analisi funzionale e molecolare dei centromeri di mammifero è stata finora resa difficile a causa della natura altamente ripetitiva del DNA centromerico.
Recentemente, abbiamo dimostrato che la rapida evoluzione delle specie del genere Equus è stata caratterizzata da una frequenza eccezionalmente elevata di eventi di riposizionamento centromerico, cioè lo spostamento della funzione centromerica lungo il cromosoma senza alcuna alterazione della sequenza di DNA; abbiamo anche dimostrato, a livello citogenetico, che molti neocentromeri Equus sono privi di estesi blocchi di sequenze satellite ripetute in tandem (Piras et al., 2010). Avvalendoci della sequenza genomica completa del cavallo, abbiamo in seguito dimostrato, a livello molecolare, la totale assenza di ripetizioni satellite dal cromosoma 11 di cavallo (ECA11), il primo neocentromero privo di DNA satellite, fissato stabilmente in diverse popolazioni equine, mai riportato (Wade et al., 2009). Queste osservazioni ci consentirono di proporre i centromeri delle specie Equus, privi di sequenze satellite, come un nuovo sistema modello per lo studio della complessa architettura funzionale dei centromeri di mammifero.
Il primo scopo del nostro lavoro è consistito nel caratterizzare la presenza e la localizzazione delle proteine centromeriche in quattro specie del genere Equus (E. caballus, E. asinus, E. burchelli, e E. grevyi), tramite una serie di sieri (di origine umana o da animali immunizzati) e anticorpi. I nostri risultati mostrano che gli anticorpi specifici contro le proteine umane CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-F e CENP-H legano tutti i centromeri degli equidi. Tuttavia, nella zebra di Grevy, CENP-B localizza non solo a tutti i centromeri, compresi quelli privi di DNA satellite, ma anche ad alcune estremità cromosomiche. I nostri risultati dimostrano che, a differenza di quanto riportato da molti precedenti lavori, la localizzazione centromerica di CENP-B non è DNA satellite-correlata. Abbiamo quindi ipotizzato l’esistenza, in questi siti telomerici, di centromeri ancestrali che si inattivarono a seguito di eventi di fusione avvenuti nel corso dell’evoluzione di tale specie. A conferma di questa ipotesi, abbiamo realizzato esperimenti di immuno-FISH con i cromosomi della zebra di Grevy e abbiamo osservato la co-localizzazione di CENP-B e delle sequenze di DNA satellite alle estremità cromosomiche. Attualmente, servendoci di vettori plasmidici esprimenti differenti domini di CENP-B fusi a una proteina reporter, stiamo indagando quali domini di tale proteina siano responsabili della localizzazione centromerica e telomerica in cellule di zebra di Grevy. Stiamo inoltre realizzando esperimenti di ChIP-seq con un siero umano contenente un alto titolo di anticorpi anti-CENP-B per studiare le sequenze di legame di CENP-B nella zebra di Grevy e nel cavallo. Quest’ultimo lavoro rientra in un progetto più ampio avente come scopo l’analisi dettagliata delle sequenze di DNA legate dalle proteine CENP in diverse specie Equus. Al momento, stiamo allestendo esperimenti di ChIP-seq con sieri specifici per la proteina CENP-A sia nel cavallo che nelle altre specie Equus in cui avevamo identificato centromeri privi di sequenze satellite che, in quanto tali, potrebbero essere simili al centromero di ECA11 (Carbone et al., 2006; Piras et al., 2009; Piras et al., 2010).
L’attività di ricerca del mio Dottorato di ricerca verterà sullo studio della funzione centromerica e della complessa architettura cromatinica dei centromeri di mammifero utilizzando come sistema modello le specie del genere Equus (cavalli, asini, zebre).
Il centromero è il locus genico necessario per la fedele ripartizione cromosomica durante i processi di divisione cellulare. Come atteso dalla sua funzionale conservazione tra gli organismi eucariotici, le proteine del centromero/cinetocore condividono generalmente una sostanziale omologia, persino fra organismi evolutivamente non imparentati. Al contrario, le sequenze di DNA centromerico sono altamente variabili in dimensione e complessità. Questo paradosso suggerisce che il centromero sia in effetti un struttura epigenetica, non strettamente dipendente dalla sequenza di DNA. L’analisi funzionale e molecolare dei centromeri di mammifero è stata finora resa difficile a causa della natura altamente ripetitiva del DNA centromerico.
Recentemente, abbiamo dimostrato che la rapida evoluzione delle specie del genere Equus è stata caratterizzata da una frequenza eccezionalmente elevata di eventi di riposizionamento centromerico, cioè lo spostamento della funzione centromerica lungo il cromosoma senza alcuna alterazione della sequenza di DNA; abbiamo anche dimostrato, a livello citogenetico, che molti neocentromeri Equus sono privi di estesi blocchi di sequenze satellite ripetute in tandem (Piras et al., 2010). Avvalendoci della sequenza genomica completa del cavallo, abbiamo in seguito dimostrato, a livello molecolare, la totale assenza di ripetizioni satellite dal cromosoma 11 di cavallo (ECA11), il primo neocentromero privo di DNA satellite, fissato stabilmente in diverse popolazioni equine, mai riportato (Wade et al., 2009). Queste osservazioni ci consentirono di proporre i centromeri delle specie Equus, privi di sequenze satellite, come un nuovo sistema modello per lo studio della complessa architettura funzionale dei centromeri di mammifero.
Il primo scopo del nostro lavoro è consistito nel caratterizzare la presenza e la localizzazione delle proteine centromeriche in quattro specie del genere Equus (E. caballus, E. asinus, E. burchelli, e E. grevyi), tramite una serie di sieri (di origine umana o da animali immunizzati) e anticorpi. I nostri risultati mostrano che gli anticorpi specifici contro le proteine umane CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-F e CENP-H legano tutti i centromeri degli equidi. Tuttavia, nella zebra di Grevy, CENP-B localizza non solo a tutti i centromeri, compresi quelli privi di DNA satellite, ma anche ad alcune estremità cromosomiche. I nostri risultati dimostrano che, a differenza di quanto riportato da molti precedenti lavori, la localizzazione centromerica di CENP-B non è DNA satellite-correlata. Abbiamo quindi ipotizzato l’esistenza, in questi siti telomerici, di centromeri ancestrali che si inattivarono a seguito di eventi di fusione avvenuti nel corso dell’evoluzione di tale specie. A conferma di questa ipotesi, abbiamo realizzato esperimenti di immuno-FISH con i cromosomi della zebra di Grevy e abbiamo osservato la co-localizzazione di CENP-B e delle sequenze di DNA satellite alle estremità cromosomiche. Attualmente, servendoci di vettori plasmidici esprimenti differenti domini di CENP-B fusi a una proteina reporter, stiamo indagando quali domini di tale proteina siano responsabili della localizzazione centromerica e telomerica in cellule di zebra di Grevy. Stiamo inoltre realizzando esperimenti di ChIP-seq con un siero umano contenente un alto titolo di anticorpi anti-CENP-B per studiare le sequenze di legame di CENP-B nella zebra di Grevy e nel cavallo. Quest’ultimo lavoro rientra in un progetto più ampio avente come scopo l’analisi dettagliata delle sequenze di DNA legate dalle proteine CENP in diverse specie Equus. Al momento, stiamo allestendo esperimenti di ChIP-seq con sieri specifici per la proteina CENP-A sia nel cavallo che nelle altre specie Equus in cui avevamo identificato centromeri privi di sequenze satellite che, in quanto tali, potrebbero essere simili al centromero di ECA11 (Carbone et al., 2006; Piras et al., 2009; Piras et al., 2010).
