Università degli studi di Pavia
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Arrigoni attività di ricerca
Role of sequence and chromatin elements in origin firing and gene silencing
Progetto 1: “Ricerca della sequenza minima necessaria all’innesco della replicazione”
La replicazione del DNA è un processo altamente organizzato nel tempo e nello spazio, che avviene a partire da sequenze genomiche distribuite lungo i cromosomi chiamate origini di replicazione. Il preciso assemblaggio del complesso pre-replicativo (pre-RC) a livello delle origini di replicazione assicura che il DNA sia replicato per intero e una sola volta per ciclo cellulare. Il complesso pre-RC è conservato negli organismi viventi ed è in grado di riconoscere diverse origini di replicazione in assenza di un’evidente sequenza consenso, e il suo legame permette l’apertura della doppia elica di DNA e la sua sintesi. In alcune origini di replicazione la sintesi bidirezionale del DNA è innescata in punti specifici (origini confinate), in maniera simile a quanto avviene nei lieviti. Altre origini di replicazione sono caratterizzate invece dalla presenza di vari siti d’innesco ad efficienza variabile (origini delocalizzate). La sequenza di DNA in grado di reclutare il pre-RC può essere distinta, in alcuni casi, dalla sequenza in cui avviene l’innesco della replicazione. Assistiamo dunque a un quadro complesso, in cui un’origine di replicazione è definita come una regione genomica di diversa ampiezza, generalmente compresa tra le 1 e le 50 kb, comprendente uno o più siti di legame del pre-RC (“replicatori”) e uno o più siti d’innesco della sintesi del DNA.
Ad oggi non è del tutto compreso il processo di riconoscimento delle sequenze del replicatore e la sequenza di eventi che controlla l’evento temporale di attivazione dell’origine durante la fase S precoce, intermedia o tardiva. Idee emergenti mostrano che molteplici fattori quali strutture tridimensionali della cromatina, zone ricche di basi AT (Rampakakis et al, 2009), vicinanza a regioni regolatorie della trascrizione (Cadoret et al, 2008) oltre che a fattori genetici (Paixão et al, 2004), determinano l’identità di un’origine. Un ruolo emergente nel dettare la tempistica di attivazione deriva dall’organizzazione tridimensionale del nucleo. È noto infatti che regioni cromatiniche che mostrano un’attivazione temporale comune condividono anche collocazioni spaziali simili all’interno del nucleo (De & Michor, 2011). Fattori genetici ed epigenetico-strutturali contribuiscono quindi alla definizione di origine e alla sua attivazione precoce o tardiva durante la fase S.
Il nostro interesse è quello di comprendere l’informazione genetica necessaria al riconoscimento della sequenza dell’origine e i processi genetici/epigenetici e/o topologici coinvolti nella tempistica di attivazione, utilizzando come modello la ben caratterizzata origine di replicazione della Lamina B2 (LamB2-ori). La LamB2-ori è collocata tra due unità trascrizionali, al 3’ del gene della Lamina B2 e al 5’ del gene TIMM13 sul braccio corto del cromosoma 19, in un ambiente cromatinico aperto. Il clonaggio di un frammento di 1.2 kb isolato dalla regione della LamB2-ori e successiva integrazione casuale in siti ectopici del genoma ha permesso di dimostrare che la sequenza possiede un’informazione genetica in grado di innescare la replicazione in sedi ectopiche (Paixão et al, 2004). Saggi di in vivo footprinting hanno formulato evidenze di un complesso sulla regione dell’origine, la cui impronta varia nel ciclo cellulare (Abdurashidova et al, 1998). Saggi di interazione DNA-proteine nella regione dell'impronta hanno rivelato la presenza di proteine del complesso pre-RC (Abdurashidova et al, 2003; Paixão et al, 2004) e mappato il punto di innesco bi-direzionale della sintesi del DNA (Abdurashidova et al, 2000). L'insieme di questi dati dimostrano che la LamB2-ori è un'origine confinata.
Per identificare le sequenze essenziali e la regione minima in grado di conferire l’attività d’innesco all’origine della LamB2-ori è stata effettuata una mutagenesi fine della regione dell’origine ed è stata valutata l’attività di innesco di tali mutanti integrati in un sito genomico costante mediante Recombinase Mediated Cassette Exchange. Lo studio di mutagenesi è volto inoltre a chiarire quali componenti dell’origine di replicazione e quali elementi cromatinico-strutturali siano richiesti per scandire il tempo di attivazione dell’origine durante la fase S. Il nostro studio sarà pertanto indirizzato alla comprensione dei processi molecolari coinvolti nel riconoscimento e nell’attivazione delle origini di replicazione nel ciclo cellulare e alla individuazione di possibili bersagli terapeutici contro il cancro.
Progetto 2: “Definizione degli elementi critici coinvolti nella prevenzione del silenziamento genico nelle origini di replicazione”
Il silenziamento genico è un fenomeno epigenetico per il quale si ha spegnimento dell’espressione di geni sia endogeni sia inseriti come transgeni, attraverso un processo di eterocromatizzazione della cromatina. Il fenomeno si genera grazie alla metilazione del DNA sulla Guanina delle coppie dei nucleotidi CpG e a modificazioni di specifiche Lisine delle code istoniche, come ad esempio la rimozione di gruppi acetili e/o l’aggiunta di gruppi metilici, che favoriscono da una parte il distacco di complessi coinvolti nell’espressione genica e dall’altra il reclutamento di proteine che conferiscono una conformazione compatta alla cromatina. Il fenomeno del silenziamento genico è essenziale durante lo sviluppo e il differenziamento e riveste un ruolo nella cancerogenesi. Inoltre, esso rappresenta uno dei maggiori impedimenti nella terapia genica e nella produzione di proteine ricombinanti in linee cellulari. Per questo motivo c’è un interesse crescente rivolto all’individuazione di sequenze e/o fattori che contrastino il silenziamento genico.
Nel corso di questi anni, sono state individuate alcune sequenze genomiche che sono in grado di prevenire gli effetti del silenziamento genico. Tra queste possiamo individuare CpG island di geni housekeeping (Williams et al, 2005), regioni di attacco alla matrice nucleare S/MAR (Allen et al, 2000) e origini di replicazione (Fu et al, 2006). Il nostro interesse è quello di chiarire il processo di prevenzione del silenziamento genico dipendente dalle origini di replicazione, usando come modello l’origine di replicazione LamB2-ori. Mediante un approccio genetico e biochimico andremo ad individuare le sequenze del replicatore e le proteine associate coinvolte nella prevenzione del silenziamento genico, inoltre studieremo l’organizzazione tridimensionale della cromatina coinvolta in questo fenomeno.
Letteratura citata
Abdurashidova G, Riva S, Biamonti G, Giacca M & Falaschi A (1998) Cell cycle modulation of protein-DNA interactions at a human replication origin. EMBO J 17: 2961–2969
Abdurashidova G, Deganuto M, Klima R, Riva S, Biamonti G, Giacca M & Falaschi A (2000) Start sites of bidirectional DNA synthesis at the human lamin B2 origin. Science 287: 2023–2026
Abdurashidova G, Danailov MB, Ochem A, Triolo G, Djeliova V, Radulescu S, Vindigni A, Riva S & Falaschi A (2003) Localization of proteins bound to a replication origin of human DNA along the cell cycle. EMBO J 22: 4294–4303
Allen GC, Spiker S & Thompson WF (2000) Use of matrix attachment regions (MARs) to minimize transgene silencing. Plant Mol Biol 43: 361–376
Cadoret J-C, Meisch F, Hassan-Zadeh V, Luyten I, Guillet C, Duret L, Quesneville H & Prioleau M-N (2008) Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proc Natl Acad Sci USA 105: 15837–15842
De S & Michor F (2011) DNA replication timing and long-range DNA interactions predict mutational landscapes of cancer genomes. Nat Biotechnol
Fu H, Wang L, Lin C-M, Singhania S, Bouhassira EE & Aladjem MI (2006) Preventing gene silencing with human replicators. Nat Biotechnol 24: 572–576
Paixão S, Colaluca IN, Cubells M, Peverali FA, Destro A, Giadrossi S, Giacca M, Falaschi A, Riva S & Biamonti G (2004) Modular structure of the human lamin B2 replicator. Mol Cell Biol 24: 2958–2967
Rampakakis E, Arvanitis DN, Di Paola D & Zannis-Hadjopoulos M (2009) Metazoan origins of DNA replication: regulation through dynamic chromatin structure. J Cell Biochem 106: 512–520
Williams S, Mustoe T, Mulcahy T, Griffiths M, Simpson D, Antoniou M, Irvine A, Mountain A & Crombie R (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells. BMC Biotechnol 5: 17
Progetto 1: “Ricerca della sequenza minima necessaria all’innesco della replicazione”
La replicazione del DNA è un processo altamente organizzato nel tempo e nello spazio, che avviene a partire da sequenze genomiche distribuite lungo i cromosomi chiamate origini di replicazione. Il preciso assemblaggio del complesso pre-replicativo (pre-RC) a livello delle origini di replicazione assicura che il DNA sia replicato per intero e una sola volta per ciclo cellulare. Il complesso pre-RC è conservato negli organismi viventi ed è in grado di riconoscere diverse origini di replicazione in assenza di un’evidente sequenza consenso, e il suo legame permette l’apertura della doppia elica di DNA e la sua sintesi. In alcune origini di replicazione la sintesi bidirezionale del DNA è innescata in punti specifici (origini confinate), in maniera simile a quanto avviene nei lieviti. Altre origini di replicazione sono caratterizzate invece dalla presenza di vari siti d’innesco ad efficienza variabile (origini delocalizzate). La sequenza di DNA in grado di reclutare il pre-RC può essere distinta, in alcuni casi, dalla sequenza in cui avviene l’innesco della replicazione. Assistiamo dunque a un quadro complesso, in cui un’origine di replicazione è definita come una regione genomica di diversa ampiezza, generalmente compresa tra le 1 e le 50 kb, comprendente uno o più siti di legame del pre-RC (“replicatori”) e uno o più siti d’innesco della sintesi del DNA.
Ad oggi non è del tutto compreso il processo di riconoscimento delle sequenze del replicatore e la sequenza di eventi che controlla l’evento temporale di attivazione dell’origine durante la fase S precoce, intermedia o tardiva. Idee emergenti mostrano che molteplici fattori quali strutture tridimensionali della cromatina, zone ricche di basi AT (Rampakakis et al, 2009), vicinanza a regioni regolatorie della trascrizione (Cadoret et al, 2008) oltre che a fattori genetici (Paixão et al, 2004), determinano l’identità di un’origine. Un ruolo emergente nel dettare la tempistica di attivazione deriva dall’organizzazione tridimensionale del nucleo. È noto infatti che regioni cromatiniche che mostrano un’attivazione temporale comune condividono anche collocazioni spaziali simili all’interno del nucleo (De & Michor, 2011). Fattori genetici ed epigenetico-strutturali contribuiscono quindi alla definizione di origine e alla sua attivazione precoce o tardiva durante la fase S.
Il nostro interesse è quello di comprendere l’informazione genetica necessaria al riconoscimento della sequenza dell’origine e i processi genetici/epigenetici e/o topologici coinvolti nella tempistica di attivazione, utilizzando come modello la ben caratterizzata origine di replicazione della Lamina B2 (LamB2-ori). La LamB2-ori è collocata tra due unità trascrizionali, al 3’ del gene della Lamina B2 e al 5’ del gene TIMM13 sul braccio corto del cromosoma 19, in un ambiente cromatinico aperto. Il clonaggio di un frammento di 1.2 kb isolato dalla regione della LamB2-ori e successiva integrazione casuale in siti ectopici del genoma ha permesso di dimostrare che la sequenza possiede un’informazione genetica in grado di innescare la replicazione in sedi ectopiche (Paixão et al, 2004). Saggi di in vivo footprinting hanno formulato evidenze di un complesso sulla regione dell’origine, la cui impronta varia nel ciclo cellulare (Abdurashidova et al, 1998). Saggi di interazione DNA-proteine nella regione dell'impronta hanno rivelato la presenza di proteine del complesso pre-RC (Abdurashidova et al, 2003; Paixão et al, 2004) e mappato il punto di innesco bi-direzionale della sintesi del DNA (Abdurashidova et al, 2000). L'insieme di questi dati dimostrano che la LamB2-ori è un'origine confinata.
Per identificare le sequenze essenziali e la regione minima in grado di conferire l’attività d’innesco all’origine della LamB2-ori è stata effettuata una mutagenesi fine della regione dell’origine ed è stata valutata l’attività di innesco di tali mutanti integrati in un sito genomico costante mediante Recombinase Mediated Cassette Exchange. Lo studio di mutagenesi è volto inoltre a chiarire quali componenti dell’origine di replicazione e quali elementi cromatinico-strutturali siano richiesti per scandire il tempo di attivazione dell’origine durante la fase S. Il nostro studio sarà pertanto indirizzato alla comprensione dei processi molecolari coinvolti nel riconoscimento e nell’attivazione delle origini di replicazione nel ciclo cellulare e alla individuazione di possibili bersagli terapeutici contro il cancro.
Progetto 2: “Definizione degli elementi critici coinvolti nella prevenzione del silenziamento genico nelle origini di replicazione”
Il silenziamento genico è un fenomeno epigenetico per il quale si ha spegnimento dell’espressione di geni sia endogeni sia inseriti come transgeni, attraverso un processo di eterocromatizzazione della cromatina. Il fenomeno si genera grazie alla metilazione del DNA sulla Guanina delle coppie dei nucleotidi CpG e a modificazioni di specifiche Lisine delle code istoniche, come ad esempio la rimozione di gruppi acetili e/o l’aggiunta di gruppi metilici, che favoriscono da una parte il distacco di complessi coinvolti nell’espressione genica e dall’altra il reclutamento di proteine che conferiscono una conformazione compatta alla cromatina. Il fenomeno del silenziamento genico è essenziale durante lo sviluppo e il differenziamento e riveste un ruolo nella cancerogenesi. Inoltre, esso rappresenta uno dei maggiori impedimenti nella terapia genica e nella produzione di proteine ricombinanti in linee cellulari. Per questo motivo c’è un interesse crescente rivolto all’individuazione di sequenze e/o fattori che contrastino il silenziamento genico.
Nel corso di questi anni, sono state individuate alcune sequenze genomiche che sono in grado di prevenire gli effetti del silenziamento genico. Tra queste possiamo individuare CpG island di geni housekeeping (Williams et al, 2005), regioni di attacco alla matrice nucleare S/MAR (Allen et al, 2000) e origini di replicazione (Fu et al, 2006). Il nostro interesse è quello di chiarire il processo di prevenzione del silenziamento genico dipendente dalle origini di replicazione, usando come modello l’origine di replicazione LamB2-ori. Mediante un approccio genetico e biochimico andremo ad individuare le sequenze del replicatore e le proteine associate coinvolte nella prevenzione del silenziamento genico, inoltre studieremo l’organizzazione tridimensionale della cromatina coinvolta in questo fenomeno.
Letteratura citata
Abdurashidova G, Riva S, Biamonti G, Giacca M & Falaschi A (1998) Cell cycle modulation of protein-DNA interactions at a human replication origin. EMBO J 17: 2961–2969
Abdurashidova G, Deganuto M, Klima R, Riva S, Biamonti G, Giacca M & Falaschi A (2000) Start sites of bidirectional DNA synthesis at the human lamin B2 origin. Science 287: 2023–2026
Abdurashidova G, Danailov MB, Ochem A, Triolo G, Djeliova V, Radulescu S, Vindigni A, Riva S & Falaschi A (2003) Localization of proteins bound to a replication origin of human DNA along the cell cycle. EMBO J 22: 4294–4303
Allen GC, Spiker S & Thompson WF (2000) Use of matrix attachment regions (MARs) to minimize transgene silencing. Plant Mol Biol 43: 361–376
Cadoret J-C, Meisch F, Hassan-Zadeh V, Luyten I, Guillet C, Duret L, Quesneville H & Prioleau M-N (2008) Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proc Natl Acad Sci USA 105: 15837–15842
De S & Michor F (2011) DNA replication timing and long-range DNA interactions predict mutational landscapes of cancer genomes. Nat Biotechnol
Fu H, Wang L, Lin C-M, Singhania S, Bouhassira EE & Aladjem MI (2006) Preventing gene silencing with human replicators. Nat Biotechnol 24: 572–576
Paixão S, Colaluca IN, Cubells M, Peverali FA, Destro A, Giadrossi S, Giacca M, Falaschi A, Riva S & Biamonti G (2004) Modular structure of the human lamin B2 replicator. Mol Cell Biol 24: 2958–2967
Rampakakis E, Arvanitis DN, Di Paola D & Zannis-Hadjopoulos M (2009) Metazoan origins of DNA replication: regulation through dynamic chromatin structure. J Cell Biochem 106: 512–520
Williams S, Mustoe T, Mulcahy T, Griffiths M, Simpson D, Antoniou M, Irvine A, Mountain A & Crombie R (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells. BMC Biotechnol 5: 17
