Università degli studi di Pavia
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Grignani attività di ricerca
Dottorato in Patologia e Genetica Medica (XXVI ciclo), Università degli Studi di Pavia.
“Analisi di SNPs coinvolti nel metabolismo di farmaci”.
Supervisori: Dott. C. Previderè e Prof. C. Danesino.
La farmacogenetica si occupa dello studio delle variabilità genetiche che influiscono nella risposta dell’organismo alla somministrazione dei farmaci. Evidenze sperimentali indicano che l’identificazione di differenze genetiche negli enzimi coinvolti nel trasporto e nel metabolismo di determinati farmaci possono contribuire a prevedere in parte la loro potenziale tossicità ed efficacia.
Relativamente al metabolismo dei farmaci, la risposta individuale dipende anche dalla diversa velocità con cui il farmaco viene metabolizzato. Un lento processo di metabolizzazione può provocare un accumulo del principio attivo della molecola nell’organismo con un conseguente nocivo sovradosaggio, mentre un veloce smaltimento può rendere inefficace l’assunzione del farmaco. La conoscenza a priori della categoria a cui appartiene un individuo consentirebbe di calibrare l’eventuale terapia farmacologica da somministrare in modo da evitare effetti collaterali che possono risultare anche di grave entità. Nella popolazione, oltre agli individui che rispondono in modo adeguato all’assunzione di un determinato farmaco, vengono distinte due principali categorie di soggetti: i metabolizzatori lenti (PM) e quelli rapidi (EM).
Durante il processo della bio-trasformazione epatica, meccanismo con il quale viene regolata la concentrazione di farmaco nell’organismo, il farmaco progenitore viene convertito in uno dei metaboliti (farmacologicamente attivi od inattivi) che sono più facilmente eliminabili con l’urina o attraverso la bile. Tale processo metabolico avviene attraverso la trasformazione dei gruppi funzionali della molecola (reazioni di fase I) e la successiva coniugazione con sostanze endogene che porta alla formazione di composti inattivi (reazioni di fase II). Le reazioni di fase I comprendono reazioni di ossidazione, riduzione e idrolisi e sono promosse a livello epatico da sistemi enzimatici come quello del Citocromo P450 (CYP).
Attualmente, per quanto riguarda il sistema del citocromo P450 sono stati identificati circa 60 geni codificanti per le varie forme isoenzimatiche e gli studi genetici svolti al riguardo hanno evidenziato che alcuni di questi geni sono polimorfici nella popolazione.
Gli isoenzimi CYP2C9 e CYP2C19 appartengono alla numerosa famiglia degli enzimi che costituiscono il sistema epatico del citocromo P450.
L’enzima CYP2C9 risulta uno dei più studiati dal punto di vista farmacogenetico, è responsabile del metabolismo di circa il 16% dei farmaci attualmente in commercio. È importante per il metabolismo di molti farmaci con range terapeutico ristretto come antiepilettici, anticoagulanti, bloccanti dell’angiotensina II, antiinfiammatori non steroidei e alcuni antidepressivi. Sono diverse le varianti alleliche individuate con frequenze variabili nei vari gruppi etnici. Nei Caucasici le varianti alleliche più comuni, oltre alla CYP2C9*1 (wild type), sono la CYP2C9*2 e la CYP2C9*3 che si differenziano per singole mutazioni (SNPs). La variante CYP2C9*2 (430T, rs1799853) determina, a livello traduzionale la codificazione di una Cys144 al posto di una Arg144 nella catena proteica, mentre la variante CYP2C9*3 (1075C, rs1057910) porta la codificazione di una Ile359 al posto di una Leu359. Queste variazioni provocano un’alterazione delle proprietà catalitiche dell’enzima con una diminuzione dell’attività enzimatica rispetto alle varianti alleliche comuni CYP2C9*1 (430C, 1075A). Esistono anche correlazioni genotipo-fenotipo che considerano i soggetti con genotipo CYP2C9*1/*1 come metabolizzatori normali, i soggetti con genotipo CYP2C9*1/*2 e *1/*3 come metabolizzatori lenti e i soggetti con genotipo CYP2C9*2/*2, *2/*3 e *3/*3 come metabolizzatori lenti.
L’enzima CYP2C19 è responsabile del metabolismo di circa il 10% dei farmaci attualmente in commercio fra questi i più importanti sono alcune benzodiazepine, alcuni anti-deprssivi triciclici, anti-malarici, barbiturici e anti-tumorali. Il gene del CYP2C19 può presentare dei polimorfismi che rendono l’enzima più o meno attivo nei confronti di determinati farmaci. La variante CYP2C19*2 (681A, rs4244285) determina un difetto dello splicing che porta alla formazione di una proteina inattiva. La variante CYP2C19*3 (636A, rs4986893) porta la formazione di un prematuro codone di stop al posto dell’aminoacido Trp212con sintesi di una proteina tronca non funzionante. Gli individui con genotipo CYP2C19*2/*2 o *2/*3 sono classificati come metabolizzatori lenti. Recentemente è stato individuato uno SNP nella regione del promotore del gene CYP2C19 in posizione -806. L’allele CYP2C19*17 (-806T, rs12248560) è stato correlato ad una categoria di metabolizzatori definiti ultra rapidi.
Nel corso del primo anno di dottorato è stato messo a punto un nuovo protocollo analitico che consente di tipizzare contemporaneamente gli alleli CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3 e gli alleli CYP2C19*1 CYP2C19*2 CYP2C19*3, CYP2C19*17. Questa metodica prevede la co-amplificazione dei frammenti dei geni CYP2C9 e CYP2C19 contenenti i siti polimorfici descritti e la successiva reazione di minisequenziamento che, mediante il kit commerciale SnaPshot (Applied Biosystems), consente l’estensione e il rilevamento su sequenziatore automatico (ABI PRISM 310) della singola base d’interesse.
“Analisi di SNPs coinvolti nel metabolismo di farmaci”.
Supervisori: Dott. C. Previderè e Prof. C. Danesino.
La farmacogenetica si occupa dello studio delle variabilità genetiche che influiscono nella risposta dell’organismo alla somministrazione dei farmaci. Evidenze sperimentali indicano che l’identificazione di differenze genetiche negli enzimi coinvolti nel trasporto e nel metabolismo di determinati farmaci possono contribuire a prevedere in parte la loro potenziale tossicità ed efficacia.
Relativamente al metabolismo dei farmaci, la risposta individuale dipende anche dalla diversa velocità con cui il farmaco viene metabolizzato. Un lento processo di metabolizzazione può provocare un accumulo del principio attivo della molecola nell’organismo con un conseguente nocivo sovradosaggio, mentre un veloce smaltimento può rendere inefficace l’assunzione del farmaco. La conoscenza a priori della categoria a cui appartiene un individuo consentirebbe di calibrare l’eventuale terapia farmacologica da somministrare in modo da evitare effetti collaterali che possono risultare anche di grave entità. Nella popolazione, oltre agli individui che rispondono in modo adeguato all’assunzione di un determinato farmaco, vengono distinte due principali categorie di soggetti: i metabolizzatori lenti (PM) e quelli rapidi (EM).
Durante il processo della bio-trasformazione epatica, meccanismo con il quale viene regolata la concentrazione di farmaco nell’organismo, il farmaco progenitore viene convertito in uno dei metaboliti (farmacologicamente attivi od inattivi) che sono più facilmente eliminabili con l’urina o attraverso la bile. Tale processo metabolico avviene attraverso la trasformazione dei gruppi funzionali della molecola (reazioni di fase I) e la successiva coniugazione con sostanze endogene che porta alla formazione di composti inattivi (reazioni di fase II). Le reazioni di fase I comprendono reazioni di ossidazione, riduzione e idrolisi e sono promosse a livello epatico da sistemi enzimatici come quello del Citocromo P450 (CYP).
Attualmente, per quanto riguarda il sistema del citocromo P450 sono stati identificati circa 60 geni codificanti per le varie forme isoenzimatiche e gli studi genetici svolti al riguardo hanno evidenziato che alcuni di questi geni sono polimorfici nella popolazione.
Gli isoenzimi CYP2C9 e CYP2C19 appartengono alla numerosa famiglia degli enzimi che costituiscono il sistema epatico del citocromo P450.
L’enzima CYP2C9 risulta uno dei più studiati dal punto di vista farmacogenetico, è responsabile del metabolismo di circa il 16% dei farmaci attualmente in commercio. È importante per il metabolismo di molti farmaci con range terapeutico ristretto come antiepilettici, anticoagulanti, bloccanti dell’angiotensina II, antiinfiammatori non steroidei e alcuni antidepressivi. Sono diverse le varianti alleliche individuate con frequenze variabili nei vari gruppi etnici. Nei Caucasici le varianti alleliche più comuni, oltre alla CYP2C9*1 (wild type), sono la CYP2C9*2 e la CYP2C9*3 che si differenziano per singole mutazioni (SNPs). La variante CYP2C9*2 (430T, rs1799853) determina, a livello traduzionale la codificazione di una Cys144 al posto di una Arg144 nella catena proteica, mentre la variante CYP2C9*3 (1075C, rs1057910) porta la codificazione di una Ile359 al posto di una Leu359. Queste variazioni provocano un’alterazione delle proprietà catalitiche dell’enzima con una diminuzione dell’attività enzimatica rispetto alle varianti alleliche comuni CYP2C9*1 (430C, 1075A). Esistono anche correlazioni genotipo-fenotipo che considerano i soggetti con genotipo CYP2C9*1/*1 come metabolizzatori normali, i soggetti con genotipo CYP2C9*1/*2 e *1/*3 come metabolizzatori lenti e i soggetti con genotipo CYP2C9*2/*2, *2/*3 e *3/*3 come metabolizzatori lenti.
L’enzima CYP2C19 è responsabile del metabolismo di circa il 10% dei farmaci attualmente in commercio fra questi i più importanti sono alcune benzodiazepine, alcuni anti-deprssivi triciclici, anti-malarici, barbiturici e anti-tumorali. Il gene del CYP2C19 può presentare dei polimorfismi che rendono l’enzima più o meno attivo nei confronti di determinati farmaci. La variante CYP2C19*2 (681A, rs4244285) determina un difetto dello splicing che porta alla formazione di una proteina inattiva. La variante CYP2C19*3 (636A, rs4986893) porta la formazione di un prematuro codone di stop al posto dell’aminoacido Trp212con sintesi di una proteina tronca non funzionante. Gli individui con genotipo CYP2C19*2/*2 o *2/*3 sono classificati come metabolizzatori lenti. Recentemente è stato individuato uno SNP nella regione del promotore del gene CYP2C19 in posizione -806. L’allele CYP2C19*17 (-806T, rs12248560) è stato correlato ad una categoria di metabolizzatori definiti ultra rapidi.
Nel corso del primo anno di dottorato è stato messo a punto un nuovo protocollo analitico che consente di tipizzare contemporaneamente gli alleli CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3 e gli alleli CYP2C19*1 CYP2C19*2 CYP2C19*3, CYP2C19*17. Questa metodica prevede la co-amplificazione dei frammenti dei geni CYP2C9 e CYP2C19 contenenti i siti polimorfici descritti e la successiva reazione di minisequenziamento che, mediante il kit commerciale SnaPshot (Applied Biosystems), consente l’estensione e il rilevamento su sequenziatore automatico (ABI PRISM 310) della singola base d’interesse.
