Università degli studi di Pavia
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Siciliano attività di ricerca
Durante il mio periodo di dottorato mi sono focalizzato sulla comunicazione chimica negli insetti, in particolare su Medfly (Ceratitis capitata), allo scopo di migliorare le tecniche di monitoraggio e controllo di questo insetto infestante.
C. capitata è un insetto che infesta principalmente le colture dell’area Mediterranea e dell’America Centrale. La sua diffusione deriva dal compartamento riproduttivo multivoltino, dall’abilità di infestare più di 250 specie di vegetali e frutti e dalla sua grande capacità di adattarsi a vari climi e condizioni. Ad oggi, la tecnica dell’insetto sterile (SIT) è l’unica strategia che ha avuto successo nell’eradicazione di questa specie dalle aree infestate. Questa tecnica particolare si basa sul rilascio in campo di maschi sterili capaci di competere con i maschi selvatici per le femmine. L’accoppiamento con individui sterili porta a una consistente diminuzione della grandezza della popolazione, non portando alla creazione di alcuna progenie. Essendo il comportamento riproduttivo altamente correlato alla percezione degli odori e dei feromoni ed essendo il programma di monitoraggio SIT esclusivamente basato su segnali olfattivi, lo studio del meccanismo olfattivo in questa specie potrebbe fornire importanti informazioni applicabili allo sviluppo di nuove strategie per l’eradicazione di questo insetto dalle zone interessate.
Non essendo ad oggi ancora disponibile il genoma di Medfly, ho analizzato due librerie di EST (precedentemente costruite nel mio laboratorio) allo scopo di identificare geni putativamente coinvolti nella percezione di odori e feromoni. Basandomi sulla similarità di sequenza con altre specie di insetti, ho identificato 28 geni codificanti per proteine appartenenti a differenti famiglie (Odorant binding proteins - OBP, Odorant receptors - OR, Chemosensory proteins - CSP), le quali sono state dimostrate avere un ruolo nel meccanismo olfattivo. Cinque geni putativi per Pheromone binding Proteins (Pbp), un sottogruppo dei geni Obp, sono stati identificati e caratterizzati determinandone struttura genica e profili di espressione in relazione a differenti compartimenti corporei ed a diverse condizioni fisiologiche. Tutti questi geni mostrano un livello medio di similarità con i putativi geni omologhi di altri insetti e sono espressi principalmente negli organi sensoriali (come antenne, palpi mascellari e tarsi). La loro espressione è in relazione alla maturità sessuale, almeno per quattro di essi. Solamente un gene si è dimostrato essere antenna specifico.
La seconda fase di questa ricerca si è basata sull’espressione eterologa e sulla successiva purificazione di queste proteine in cellule di E. coli. Al momento solo la CcPBP4 (antenna specifica) è stata purificata con successo attraverso cromatografia a scambio ionico e per gel filtrazione da cellule batteriche trasformate, mentre l’espressione e purificazione delle proteine CcPBP1, 2, 3 e 5 è ancora in corso.
Allo scopo di identificare gli attori principali della comunicazione chimica in medfly, i feromoni prodotti da individui maturi sono stati isolati e caratterizzati. I composti volatili emessi da maschi e femmine durante il periodo di “calling” (il periodo durante il quale i maschi attraggono le femmine attraverso segnali visivi, olfattivi e acustici) sono stati isolati e analizzati tramite GC. 19 composti sono stati isolati dalle emissioni maschili, mentre le femmine non sembrano emettere durante questo lasso di tempo. Quattro di questi composti rimangono al momento ancora sconosciuti. I restanti 15 hanno dimostrato generare un’intensa risposta a livello delle antenne in entrambi i sessi quando testate con GC accoppiata ad elettroantennogramma (GC-EAG).
L’ultima fase di questo progetto di dottorato è stata l’analisi dell’interazione tra composti attivi appartenenti alla miscela di sostanze emessa dai maschi di Medfly e le CcPBPs purificate. Saggi di legame sono stati condotti mediante lettura di diminuzione della fluorescenza in relazione al dislocamento di un ligando fluorescente (1-NPN) specifico per le OBPs di insetto. CcPBP4 ha mostrato un’alta affinità di legame verso uno dei composti maggiormente emessi nella mistura di feromoni. I risultati ottenuti ci hanno permesso di scoprire interazioni proteina-ligando specifiche dandoci una prima visione sulla percezione dei feromoni in Medfly e fornendoci strumenti utili per possibili applicazioni in campo.
C. capitata è un insetto che infesta principalmente le colture dell’area Mediterranea e dell’America Centrale. La sua diffusione deriva dal compartamento riproduttivo multivoltino, dall’abilità di infestare più di 250 specie di vegetali e frutti e dalla sua grande capacità di adattarsi a vari climi e condizioni. Ad oggi, la tecnica dell’insetto sterile (SIT) è l’unica strategia che ha avuto successo nell’eradicazione di questa specie dalle aree infestate. Questa tecnica particolare si basa sul rilascio in campo di maschi sterili capaci di competere con i maschi selvatici per le femmine. L’accoppiamento con individui sterili porta a una consistente diminuzione della grandezza della popolazione, non portando alla creazione di alcuna progenie. Essendo il comportamento riproduttivo altamente correlato alla percezione degli odori e dei feromoni ed essendo il programma di monitoraggio SIT esclusivamente basato su segnali olfattivi, lo studio del meccanismo olfattivo in questa specie potrebbe fornire importanti informazioni applicabili allo sviluppo di nuove strategie per l’eradicazione di questo insetto dalle zone interessate.
Non essendo ad oggi ancora disponibile il genoma di Medfly, ho analizzato due librerie di EST (precedentemente costruite nel mio laboratorio) allo scopo di identificare geni putativamente coinvolti nella percezione di odori e feromoni. Basandomi sulla similarità di sequenza con altre specie di insetti, ho identificato 28 geni codificanti per proteine appartenenti a differenti famiglie (Odorant binding proteins - OBP, Odorant receptors - OR, Chemosensory proteins - CSP), le quali sono state dimostrate avere un ruolo nel meccanismo olfattivo. Cinque geni putativi per Pheromone binding Proteins (Pbp), un sottogruppo dei geni Obp, sono stati identificati e caratterizzati determinandone struttura genica e profili di espressione in relazione a differenti compartimenti corporei ed a diverse condizioni fisiologiche. Tutti questi geni mostrano un livello medio di similarità con i putativi geni omologhi di altri insetti e sono espressi principalmente negli organi sensoriali (come antenne, palpi mascellari e tarsi). La loro espressione è in relazione alla maturità sessuale, almeno per quattro di essi. Solamente un gene si è dimostrato essere antenna specifico.
La seconda fase di questa ricerca si è basata sull’espressione eterologa e sulla successiva purificazione di queste proteine in cellule di E. coli. Al momento solo la CcPBP4 (antenna specifica) è stata purificata con successo attraverso cromatografia a scambio ionico e per gel filtrazione da cellule batteriche trasformate, mentre l’espressione e purificazione delle proteine CcPBP1, 2, 3 e 5 è ancora in corso.
Allo scopo di identificare gli attori principali della comunicazione chimica in medfly, i feromoni prodotti da individui maturi sono stati isolati e caratterizzati. I composti volatili emessi da maschi e femmine durante il periodo di “calling” (il periodo durante il quale i maschi attraggono le femmine attraverso segnali visivi, olfattivi e acustici) sono stati isolati e analizzati tramite GC. 19 composti sono stati isolati dalle emissioni maschili, mentre le femmine non sembrano emettere durante questo lasso di tempo. Quattro di questi composti rimangono al momento ancora sconosciuti. I restanti 15 hanno dimostrato generare un’intensa risposta a livello delle antenne in entrambi i sessi quando testate con GC accoppiata ad elettroantennogramma (GC-EAG).
L’ultima fase di questo progetto di dottorato è stata l’analisi dell’interazione tra composti attivi appartenenti alla miscela di sostanze emessa dai maschi di Medfly e le CcPBPs purificate. Saggi di legame sono stati condotti mediante lettura di diminuzione della fluorescenza in relazione al dislocamento di un ligando fluorescente (1-NPN) specifico per le OBPs di insetto. CcPBP4 ha mostrato un’alta affinità di legame verso uno dei composti maggiormente emessi nella mistura di feromoni. I risultati ottenuti ci hanno permesso di scoprire interazioni proteina-ligando specifiche dandoci una prima visione sulla percezione dei feromoni in Medfly e fornendoci strumenti utili per possibili applicazioni in campo.
