Università degli studi di Pavia
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Peverali attività di ricerca
Linee di ricerca:
1- Processi genetici ed epigenetici coinvolti nell’innesco della replicazione.
2- Sviluppo di nuove strategie per la prevenzione del silenziamento di transgeni di interesse biomedico mediante l’impiego di replicatori.
La duplicazione del patrimonio genetico e la sua ripartizione nelle cellule figlie rappresentano lo "Ying" e lo "Yang" del ciclo cellulare. Questi due eventi, strettamente interconnessi, permettono alla cellula di propagare fedelmente l’informazione genetica alle generazioni future. Alterazioni genetiche ed epigenetiche che avvengono in queste fasi causano instabilità genomica che possono favorire l’insorgenza di cancro, difetti dello sviluppo, suscettibilità a varie patologie e invecchiamento. Non è ancora chiaro come avviene il processo di innesco della replicazione né come questo evento si coordini con la struttura e organizzazione della cromatina e del nucleo, né quale sia il ruolo del codice epigenetico, della trascrizione e delle proteine associate alla cromatina nella selezione dei punti di innesco. La comprensione di questi processi molecolari costituisce un'affascinante sfida della moderna biologia e getta le basi per la risoluzione di gravi patologie e lo sviluppo di nuove biotecnologie.
1- Processi genetici ed epigenetici coinvolti nell’innesco della replicazione.
Negli eucarioti il genoma è replicato in porzioni di DNA detti repliconi, la cui duplicazione è discontinua nel tempo e nello spazio. Elementi chiave di questa regolazione sono sequenze del genoma dette origini di replicazione che coordinano l’innesco della replicazione di ciascun replicone. Le origini di replicazione sono attivate in numero variabile in base alla durata della fase di sintesi (S) del DNA, alcune sono costitutive, altre tessuto specifiche o attivate solo in tessuti neoplastici. Il processo di innesco avviene attraverso un complesso meccanismo finemente regolato a partire dal reclutamento sequenziale di proteine del complesso di pre-replicazione (preRC), quali ORC, Cdc6, Cdt1, MCM ecc, seguito dall’assemblaggio del complesso di pre-inizio che autorizza l’origine a reclutare da ultimo l’apparato enzimatico di replicazione del DNA. Questo sofisticato sistema di comunicazione molecolare non solo conferisce plasticità e ridondanza, ma anche esercita un controllo rigoroso sull’apparato replicativo consentendo un solo innesco per replicone per ciclo cellulare.
Sebbene le origini siano ereditate nelle cellule figlie e il complesso proteico assemblato sulle origini sia altamente conservato dai lieviti, agli invertebrati e ai mammiferi, il confronto tra varie origini non ha rivelato una conservazione di sequenza evidente, fatta eccezione per le sequenze ARS (autonomously replicating region) del lievito S. cerevisiae.
Non e’ del tutto chiaro se il processo di riconoscimento dell’origine sia determinato dalla composizione primaria della sequenza dell’origine stessa, se proteine associate alla cromatina, RNA non codificanti e/o fattori epigenetici promuovano l’innesco della replicazione a partire da una qualsiasi sequenza genomica reclutando il pre-RC. Il nostro gruppo ha prodotto evidenze a sostegno di una base genetica nel processo di riconoscimento dimostrando che una sequenza ricombinante di DNA di circa 1.2kb contenente l’origine di replicazione umana associata al gene della lamina B2 (LamB2-ori) è in grado di promuovere l’innesco della replicazione in sedi ectopiche del genoma umano. In laboratorio sono in corso studi di mutagenesi sito-specifica della LamB2-ori mediante scambio di cassette (Recombinase Mediated Cassette Exchange, RMCE) volti a definire la sequenza minima di innesco e gli elementi essenziali al suo innesco. Inoltre, saggi di immunoprecipitazione della cromatina e di ricostruzione 3-D della cromatina in corso suggeriscono un’organizzazione complessa del processo di riconoscimento dell’origine e della tempistica di attivazione dell’origine.
2-Sviluppo di nuove strategie per la prevenzione del silenziamento di transgeni di interesse biomedico mediante l’impiego di replicatori.
Il silenziamento genico è un processo molecolare che porta al progressivo spegnimento dell’espressione genica mediante modificazioni epigenetiche della cromatina. Questo evento avviene naturalmente in alcuni geni durante lo sviluppo, ma può accadere anche in processi patologici associati all’insorgenza e alla progressione di neoplasie, quali ad esempio cancro della prostata, del seno e altri, come conseguenza dello spegnimento di oncosoppressori. Il silenziamento genico è inoltre un evento molto limitante nella terapia genica e in applicazioni biotecnologiche.
In questo progetto, lo studio è rivolto alla comprensione dei processi molecolari coinvolti nella prevenzione del silenziamento genico mediato da origini di replicazione.
1- Processi genetici ed epigenetici coinvolti nell’innesco della replicazione.
2- Sviluppo di nuove strategie per la prevenzione del silenziamento di transgeni di interesse biomedico mediante l’impiego di replicatori.
La duplicazione del patrimonio genetico e la sua ripartizione nelle cellule figlie rappresentano lo "Ying" e lo "Yang" del ciclo cellulare. Questi due eventi, strettamente interconnessi, permettono alla cellula di propagare fedelmente l’informazione genetica alle generazioni future. Alterazioni genetiche ed epigenetiche che avvengono in queste fasi causano instabilità genomica che possono favorire l’insorgenza di cancro, difetti dello sviluppo, suscettibilità a varie patologie e invecchiamento. Non è ancora chiaro come avviene il processo di innesco della replicazione né come questo evento si coordini con la struttura e organizzazione della cromatina e del nucleo, né quale sia il ruolo del codice epigenetico, della trascrizione e delle proteine associate alla cromatina nella selezione dei punti di innesco. La comprensione di questi processi molecolari costituisce un'affascinante sfida della moderna biologia e getta le basi per la risoluzione di gravi patologie e lo sviluppo di nuove biotecnologie.
1- Processi genetici ed epigenetici coinvolti nell’innesco della replicazione.
Negli eucarioti il genoma è replicato in porzioni di DNA detti repliconi, la cui duplicazione è discontinua nel tempo e nello spazio. Elementi chiave di questa regolazione sono sequenze del genoma dette origini di replicazione che coordinano l’innesco della replicazione di ciascun replicone. Le origini di replicazione sono attivate in numero variabile in base alla durata della fase di sintesi (S) del DNA, alcune sono costitutive, altre tessuto specifiche o attivate solo in tessuti neoplastici. Il processo di innesco avviene attraverso un complesso meccanismo finemente regolato a partire dal reclutamento sequenziale di proteine del complesso di pre-replicazione (preRC), quali ORC, Cdc6, Cdt1, MCM ecc, seguito dall’assemblaggio del complesso di pre-inizio che autorizza l’origine a reclutare da ultimo l’apparato enzimatico di replicazione del DNA. Questo sofisticato sistema di comunicazione molecolare non solo conferisce plasticità e ridondanza, ma anche esercita un controllo rigoroso sull’apparato replicativo consentendo un solo innesco per replicone per ciclo cellulare.
Sebbene le origini siano ereditate nelle cellule figlie e il complesso proteico assemblato sulle origini sia altamente conservato dai lieviti, agli invertebrati e ai mammiferi, il confronto tra varie origini non ha rivelato una conservazione di sequenza evidente, fatta eccezione per le sequenze ARS (autonomously replicating region) del lievito S. cerevisiae.
Non e’ del tutto chiaro se il processo di riconoscimento dell’origine sia determinato dalla composizione primaria della sequenza dell’origine stessa, se proteine associate alla cromatina, RNA non codificanti e/o fattori epigenetici promuovano l’innesco della replicazione a partire da una qualsiasi sequenza genomica reclutando il pre-RC. Il nostro gruppo ha prodotto evidenze a sostegno di una base genetica nel processo di riconoscimento dimostrando che una sequenza ricombinante di DNA di circa 1.2kb contenente l’origine di replicazione umana associata al gene della lamina B2 (LamB2-ori) è in grado di promuovere l’innesco della replicazione in sedi ectopiche del genoma umano. In laboratorio sono in corso studi di mutagenesi sito-specifica della LamB2-ori mediante scambio di cassette (Recombinase Mediated Cassette Exchange, RMCE) volti a definire la sequenza minima di innesco e gli elementi essenziali al suo innesco. Inoltre, saggi di immunoprecipitazione della cromatina e di ricostruzione 3-D della cromatina in corso suggeriscono un’organizzazione complessa del processo di riconoscimento dell’origine e della tempistica di attivazione dell’origine.
2-Sviluppo di nuove strategie per la prevenzione del silenziamento di transgeni di interesse biomedico mediante l’impiego di replicatori.
Il silenziamento genico è un processo molecolare che porta al progressivo spegnimento dell’espressione genica mediante modificazioni epigenetiche della cromatina. Questo evento avviene naturalmente in alcuni geni durante lo sviluppo, ma può accadere anche in processi patologici associati all’insorgenza e alla progressione di neoplasie, quali ad esempio cancro della prostata, del seno e altri, come conseguenza dello spegnimento di oncosoppressori. Il silenziamento genico è inoltre un evento molto limitante nella terapia genica e in applicazioni biotecnologiche.
In questo progetto, lo studio è rivolto alla comprensione dei processi molecolari coinvolti nella prevenzione del silenziamento genico mediato da origini di replicazione.
