Università degli studi di Pavia

Nuove molecole con attività antitubercolare: studio del bersaglio cellulare e del meccanismo d'azione e di resistenza.

 

I micobatteri sono la causa di molte malattie, inclusa la tubercolosi (TB), la lebbra ed infezioni sistemiche in pazienti affetti da AIDS. Il trattamento delle infezioni micobatteriche è spesso difficile a causa della resistenza intrinseca nei confronti dei comuni farmaci impiegati in terapia. La TB è diventata un problema ancora più grave a causa dell'insorgenza dell'HIV, dell'aumento dei ceppi di Mycobacterium tuberculosisresistenti agli antibiotici (MDR-TB), e dell'aumento dell'incidenza di infezioni causate da M. aviumcomplex, in particolare in individui affetti da AIDS. La resistenza è stata osservata nei confronti di tutti e cinque i farmaci di prima linea, quali l'isoniazide, la rifampicina, la pirazinamide, la streptomicina e l'etambutolo, e nei confronti di alcuni dei farmaci di seconda linea. Un ulteriore problema, specialmente nelle popolazioni con elevata incidenza di HIV e con poche risorse per la cura dell'AIDS, è rappresentato dalla comparsa dei ceppi detti eXtensively Drug Resistant TB (XDR-TB). Questi sono ceppi MDR resistenti anche ai fluorochinoloni e ad almeno uno dei tre farmaci iniettabili di seconda linea (capreomicina, kanamicina, e amikacina) e, pertanto, i pazienti infettati da ceppi XDR (compresi quelli affetti da AIDS) sono virtualmente non curabili con i farmaci attualmente disponibili. Alla luce di tutto ciò, sono necessari nuovi farmaci, appartenenti a nuove classi e con bersagli diversi da quelli noti.

Due sono le linee di ricerca attive:

 

1) Identificazione e caratterizzazione del bersaglio cellulare di derivati pirrolici

BM212 è un derivato pirrolico molto attivo contro M. tuberculosis, micobatteri atipici come M. avium, isolati clinici di M. tuberculosismultiresistenti e bacilli intracellulari. Sulla base di questi risultati, BM212 è considerato il composto “lead” di questa nuova classe di derivati ed uno dei promettenti futuri agenti antituberculari. L’obbiettivo di questa linea di ricerca è stato l’identificazione e la caratterizzazione del bersaglio cellulare. Mediante l’isolamento e la caratterizzazione di mutanti di M. smegmatisresistenti a BM212 sono state identificate tre proteine come possibili bersagli di BM212. Solo nel gene MSMEG_0250, codificante la proteina di membrana MmpL3 a funzione ignota, sono state trovate mutazioni che provocano sostituzioni amminoacidiche.Poiché mutazioni nel gene codificante il bersaglio di un antibiotico possono essere responsabili dell’insorgenza della resistenza al farmaco stesso, la proteina MmpL3potrebbe rappresentare il bersaglio di questo composto.Dal momento che le proteine MmpL hanno una struttura simile a proteine della famiglia RND, costituita da pompe di efflusso tipiche dei batteri Gram-negativi in grado di espellereantibiotici dalla cellula, è stato verificato che la proteina MmpL3 non fosse responsabile dell’espulsione di BM212 dalla cellula e quindi della resistenza al composto.Indicazione che la proteina non sia una pompa di efflusso deriva dal fatto che la MIC di BM212 in presenza di inibitori di pompe di efflusso non subisce variazioni, suggerendo che sia effettivamente il bersaglio di BM212. Se la proteina è una pompa di efflusso, in mancanza di energia non espelle l’antibiotico, che si accumula all’interno della cellula, causando una riduzione della MIC. Saggi microbiologici ed esperimenti di accumulo/efflusso di BM212 marcato con 14C confermano che la proteina non è una pompa di efflusso ma il bersaglio cellulare di BM212.

Mutazioni che causano sostituzioni amminoacidiche sono state identificate anche nel gene mmpL3di mutanti di M. bovisBCG e M. tuberculosisresistenti a BM212.

La caratterizzazione della proteina MmpL3 rappresenta il punto di partenza per studi di “molecular modeling” e per la sintesi di derivati più attivi.

 

2) Identificazione e caratterizzazione del bersaglio cellulare dei benzotiazinoni e di altre molecole ad attività antitubercolare

Questa ricerca è inserita in un Progetto dal titolo “New Medicines for Tuberculosis”, finanziato dalla Commissione Europea (VI FP). All’interno di questo progetto, è stato identificato il bersaglio di un nuovo farmaco antitubercolare, appartenente alla classe dei benzotiazinoni (BTZ-NO2), particolarmente efficace contro M. tuberculosis(compresi i ceppi MDR e XDR). L’enzima Rv3790 (o DprE1) è il bersaglio cellulare del farmaco BTZ043 in quanto sia l’iper-espressione del gene Rv3790che mutazioni nel codone codificante un residuo di cisteina conferiscono alti livelli di resistenza al BTZ-NO2. E’ stato precedentemente dimostrato che gli enzimi Rv3790 e Rv3791 sono coinvolti nella biosintesi dell’arabinogalattano, un componente importante della parete cellulare micobatterica. In particolare, questi enzimi sono responsabili della formazione del decaprenyl-P-arabinosio (DPA), un precursore fondamentale nella sintesi dell’arabinano. Mediante saggio enzimatico è stato confermato che, nei micobatteri, la sintesi di DPA è inibita dalla presenza di BTZ043 nei ceppi wild type, ma non nei mutanti resistenti. E’ stata inoltre identificata in M. smegmatisla nitroreduttasi NfnB in grado di trasformare il farmaco BTZ043-NO2nel derivato BTZ-NH2, molto meno attivo. L’ulteriore caratterizzazione delle proteine Rv3790 e NfnB fornirà informazioni per disegnare benzotiazinoni ancora più efficaci nella lotta alla tubercolosi.

Nell’ambito del nuovo progetto dal titolo “More Medicines for Tuberculosis”, finanziato dalla Commissione Europea (VII FP), è iniziato lo studio del bersaglio cellulare e del meccanismo di azione di nuove molecole ad attività antitubercolare.