Università degli studi di Pavia
Contenuto della pagina
Raimondi attività di ricerca
CITOGENETICA MOLECOLARE
Le ricerche condotte nel Laboratorio di Citogenetica Molecolare sono incentrate sullo studio della plasticità del genoma, sull'analisi dei meccanismi alla base dell'evoluzione dei cariotipi e sullo studio dell'organizzazione fisica del centromero dei mammiferi. Viene utilizzato un sistema biologico modello rappresentato dalle specie appartenenti al genere Equus e le ricerche sono svolte in collaborazione con il Laboratorio di Biologia Molecolare e Cellulare del Dipartimento di Biologia e Biotecnologie dell'Università di Pavia diretto dalla Prof.ssa Elena Giulotto.
Gli Equidi fanno parte dell’ordine dei Perissodattili che include tre famiglie: Equidi, Tapiridi e Rinocerotidi. Tutte le specie viventi della famiglia degli Equidi appartengono al genere Equus. Nei diversi rami dei Perissodattili, il tasso evolutivo è simile a quello degli altri mammiferi, la situazione cambia radicalmente con la radiazione del genere Equus, avvenuta 2-3 milioni di anni fa, infatti è stato osservato un incremento di 80 volte del tasso evolutivo degli Equidi rispetto a quello dei Ceratomorfi antichi. I Perissodattili sono particolarmente interessanti anche da un punto di vista citogenetico per la grande variabilità del numero cromosomico diploide (2n) con 2n = 32-66 negli Equidi, 2n = 52-80 nei Tapiridi e 2n = 82-84 nei Rinocerotidi. Gli Equidi in particolare, nonostante la recente divergenza, la somiglianza morfologica e la possibilità d'incrocio tra specie diverse, presentano cariotipi molto diversi tra loro sia per il numero sia per la struttura dei cromosomi. In questo scenario, i genomi degli Equidi sembrano particolarmente adatti per ottenere dati molecolari sulla dinamica evolutiva all’interno di una specie e tra specie diverse.
1. Evoluzione del cariotipo
Studi comparativi dei cromosomi dei Perissodattili, effettuati utilizzando approcci di “chromosome painting” interspecifico multidirezionale, hanno portato alla costruzione di mappe comparative a tutto genoma di dieci diverse specie di Perissodattili, permettendo la ricostruzione dell’ipotetico cariotipo ancestrale dei Perissodattili.
Abbiamo utilizzato un approccio citogenetico molecolare ad alta risoluzione per effettuare la localizzazione cromosomica comparata di sequenze a singola copia su cromosomi di cavallo, di asino e di due zebre. I risultati preliminari indicano che alcuni cromosomi, ad oggi ritenuti ortologhi, sono in realtà originati da riarrangiamenti cromosomici indipendenti. Questi dati, contribuiranno a chiarire alcuni meccanismi alla base dell'evoluzione cromosomica consentendo di far luce su nodi ancora dibattuti relativi alla radiazione di specie correlate appartenenti al genere Equus.
2. Studio dell'organizzazione del centromero
La segregazione dei cromosomi è la base dell'ereditarietà, essenziale per lo sviluppo normale, ma anche, qualora questa funzione sia compromessa, coinvolta nell'insorgenza di patologie, in particolare tumori e malattie che compromettono la normale fertilità o lo sviluppo. L'elemento cromosomico che presiede alla segregazione è il centromero, la costrizione primaria dei cromosomi mitotici. Il centromero è una struttura enigmatica e la conoscenza delle sue caratteristiche rappresenta uno degli obiettivi fondamentali della biologia. Al contrario di quanto avviene per altri loci genetici, la funzione dei centromeri non è determinata dalla sequenza sottostante, ma piuttosto dalle proteine che si associano a domini di DNA che mostrano una straordinaria plasticità nel corso dell'evoluzione.
In un lavoro precedente, in collaborazione con il laboratorio diretto dalla Prof. E. Giulotto, abbiamo dimostrato che due famiglie di DNA satellite altamente conservate sono localizzate nella regione centromerica di tutti i cromosomi di cavallo, mentre mostrano una localizzazione prevalentemente telomerica nell’asino e in due specie di zebra. I risultati di questo lavoro hanno permesso di ipotizzare che, contrariamente a quanto osservato in tutti i vertebrati, negli Equidi la funzione centromerica non è vincolata alla presenza di DNA altamente ripetuto. Abbiamo messo a punto una tecnica di ibridazione in situ in fluorescenza ad alta risoluzione su fibre di cromatina estesa accoppiata ad immunofluorescenza con anticorpi diretti contro proteine costituenti il cinetocoro (immuno-FISH). Questo tipo di esperimenti consente di analizzare l'organizzazione fisica di diverse famiglie di DNA satellite centromerico e di accertarne l'interazione con le proteine centromeriche, ci proponiamo di stabilire quali e quante famiglie di DNA satellite equino siano direttamente coinvolte nella funzione centromerica. Inoltre, nell'ambito di un lavoro mirato alla definizione della sequenza completa del genoma di cavallo, è stata determinata la sequenza del centromero del cromosoma 11. Si tratta di un neocentromero evolutivo completamente privo di sequenze di DNA satellite ed è l'unico centromero di Equidi a oggi completamente sequenziato. Mediante esperimenti di immuno-FISH, utilizzando come sonde sequenze di DNA a singola copia localizzate nel centromero funzionale del cromosoma 11 di cavallo, ci proponiamo di definire quali sono i domini funzionali responsabili della funzione centromerica.
3. Polimorfismo d'inserzione
Una frazione rilevante del genoma dei mammiferi è rappresentata da sequenze ripetute intersperse generate dalla propagazione di elementi trasponibili nel corso dell'evoluzione. Le sequenze brevi ripetute intersperse (Short INterspersed Elements, SINEs) sono retrotrasposoni non autonomi che utilizzano un meccanismo di trasposizione nel quale un intermedio a RNA è retro-trascritto e il cDNA risultante viene inserito in una nuova posizione genomica. In dipendenza dal momento in cui si è inserita in un certo locus, una sequenza d’inserzione può essere presente in tutti gli individui di una specie (fissata) o solo in alcuni (polimorfismo d’inserzione). Anche se gli elementi trasponibili sono considerati "DNA spazzatura", esistono diversi esempi in cui hanno acquisito un ruolo funzionale, questo processo è definito "exaptation" e fornisce una spiegazione dell'origine di alcune sequenze genomiche altamente conservate nei vertebrati. L'inserzione di elementi trasponibili all'interno di geni o nelle immediate vicinanze può alterare la struttura dei geni o la loro espressione tramite l'interruzione del gene e l'introduzione di sequenze promotore o di siti di splicing. In rari casi, i trasposoni sono coinvolti nello sviluppo di malattie e tumori.
Stiamo svolgendo uno studio "a tutto genoma" di una famiglia di sequenze SINE, specifica dei perissodattili, denominata ERE (Equine Repetitive Elements), concentrando la nostra attenzione sul polimorfismo d'inserzione in relazione alla conservazione della sequenza. Inoltre, con l'obiettivo di studiare se gli elementi ERE possono giocare un ruolo nel modulare l'espressione genica e nell'evoluzione della funzione di alcuni geni, abbiamo ricercato elementi d'inserzione ERE all'interno di introni o nella regione regolatrice al 5' dei geni del cavallo. I risultati preliminari di queste indagini dimostrano che una frazione superiore rispetto all'atteso di elementi ERE si trova all'interno di sequenze introniche, inoltre abbiamo avuto modo di osservare che alcune sequenze ERE sono localizzate nelle immediate vicinanze del promotore di geni espressi.
Le ricerche condotte nel Laboratorio di Citogenetica Molecolare sono incentrate sullo studio della plasticità del genoma, sull'analisi dei meccanismi alla base dell'evoluzione dei cariotipi e sullo studio dell'organizzazione fisica del centromero dei mammiferi. Viene utilizzato un sistema biologico modello rappresentato dalle specie appartenenti al genere Equus e le ricerche sono svolte in collaborazione con il Laboratorio di Biologia Molecolare e Cellulare del Dipartimento di Biologia e Biotecnologie dell'Università di Pavia diretto dalla Prof.ssa Elena Giulotto.
Gli Equidi fanno parte dell’ordine dei Perissodattili che include tre famiglie: Equidi, Tapiridi e Rinocerotidi. Tutte le specie viventi della famiglia degli Equidi appartengono al genere Equus. Nei diversi rami dei Perissodattili, il tasso evolutivo è simile a quello degli altri mammiferi, la situazione cambia radicalmente con la radiazione del genere Equus, avvenuta 2-3 milioni di anni fa, infatti è stato osservato un incremento di 80 volte del tasso evolutivo degli Equidi rispetto a quello dei Ceratomorfi antichi. I Perissodattili sono particolarmente interessanti anche da un punto di vista citogenetico per la grande variabilità del numero cromosomico diploide (2n) con 2n = 32-66 negli Equidi, 2n = 52-80 nei Tapiridi e 2n = 82-84 nei Rinocerotidi. Gli Equidi in particolare, nonostante la recente divergenza, la somiglianza morfologica e la possibilità d'incrocio tra specie diverse, presentano cariotipi molto diversi tra loro sia per il numero sia per la struttura dei cromosomi. In questo scenario, i genomi degli Equidi sembrano particolarmente adatti per ottenere dati molecolari sulla dinamica evolutiva all’interno di una specie e tra specie diverse.
1. Evoluzione del cariotipo
Studi comparativi dei cromosomi dei Perissodattili, effettuati utilizzando approcci di “chromosome painting” interspecifico multidirezionale, hanno portato alla costruzione di mappe comparative a tutto genoma di dieci diverse specie di Perissodattili, permettendo la ricostruzione dell’ipotetico cariotipo ancestrale dei Perissodattili.
Abbiamo utilizzato un approccio citogenetico molecolare ad alta risoluzione per effettuare la localizzazione cromosomica comparata di sequenze a singola copia su cromosomi di cavallo, di asino e di due zebre. I risultati preliminari indicano che alcuni cromosomi, ad oggi ritenuti ortologhi, sono in realtà originati da riarrangiamenti cromosomici indipendenti. Questi dati, contribuiranno a chiarire alcuni meccanismi alla base dell'evoluzione cromosomica consentendo di far luce su nodi ancora dibattuti relativi alla radiazione di specie correlate appartenenti al genere Equus.
2. Studio dell'organizzazione del centromero
La segregazione dei cromosomi è la base dell'ereditarietà, essenziale per lo sviluppo normale, ma anche, qualora questa funzione sia compromessa, coinvolta nell'insorgenza di patologie, in particolare tumori e malattie che compromettono la normale fertilità o lo sviluppo. L'elemento cromosomico che presiede alla segregazione è il centromero, la costrizione primaria dei cromosomi mitotici. Il centromero è una struttura enigmatica e la conoscenza delle sue caratteristiche rappresenta uno degli obiettivi fondamentali della biologia. Al contrario di quanto avviene per altri loci genetici, la funzione dei centromeri non è determinata dalla sequenza sottostante, ma piuttosto dalle proteine che si associano a domini di DNA che mostrano una straordinaria plasticità nel corso dell'evoluzione.
In un lavoro precedente, in collaborazione con il laboratorio diretto dalla Prof. E. Giulotto, abbiamo dimostrato che due famiglie di DNA satellite altamente conservate sono localizzate nella regione centromerica di tutti i cromosomi di cavallo, mentre mostrano una localizzazione prevalentemente telomerica nell’asino e in due specie di zebra. I risultati di questo lavoro hanno permesso di ipotizzare che, contrariamente a quanto osservato in tutti i vertebrati, negli Equidi la funzione centromerica non è vincolata alla presenza di DNA altamente ripetuto. Abbiamo messo a punto una tecnica di ibridazione in situ in fluorescenza ad alta risoluzione su fibre di cromatina estesa accoppiata ad immunofluorescenza con anticorpi diretti contro proteine costituenti il cinetocoro (immuno-FISH). Questo tipo di esperimenti consente di analizzare l'organizzazione fisica di diverse famiglie di DNA satellite centromerico e di accertarne l'interazione con le proteine centromeriche, ci proponiamo di stabilire quali e quante famiglie di DNA satellite equino siano direttamente coinvolte nella funzione centromerica. Inoltre, nell'ambito di un lavoro mirato alla definizione della sequenza completa del genoma di cavallo, è stata determinata la sequenza del centromero del cromosoma 11. Si tratta di un neocentromero evolutivo completamente privo di sequenze di DNA satellite ed è l'unico centromero di Equidi a oggi completamente sequenziato. Mediante esperimenti di immuno-FISH, utilizzando come sonde sequenze di DNA a singola copia localizzate nel centromero funzionale del cromosoma 11 di cavallo, ci proponiamo di definire quali sono i domini funzionali responsabili della funzione centromerica.
3. Polimorfismo d'inserzione
Una frazione rilevante del genoma dei mammiferi è rappresentata da sequenze ripetute intersperse generate dalla propagazione di elementi trasponibili nel corso dell'evoluzione. Le sequenze brevi ripetute intersperse (Short INterspersed Elements, SINEs) sono retrotrasposoni non autonomi che utilizzano un meccanismo di trasposizione nel quale un intermedio a RNA è retro-trascritto e il cDNA risultante viene inserito in una nuova posizione genomica. In dipendenza dal momento in cui si è inserita in un certo locus, una sequenza d’inserzione può essere presente in tutti gli individui di una specie (fissata) o solo in alcuni (polimorfismo d’inserzione). Anche se gli elementi trasponibili sono considerati "DNA spazzatura", esistono diversi esempi in cui hanno acquisito un ruolo funzionale, questo processo è definito "exaptation" e fornisce una spiegazione dell'origine di alcune sequenze genomiche altamente conservate nei vertebrati. L'inserzione di elementi trasponibili all'interno di geni o nelle immediate vicinanze può alterare la struttura dei geni o la loro espressione tramite l'interruzione del gene e l'introduzione di sequenze promotore o di siti di splicing. In rari casi, i trasposoni sono coinvolti nello sviluppo di malattie e tumori.
Stiamo svolgendo uno studio "a tutto genoma" di una famiglia di sequenze SINE, specifica dei perissodattili, denominata ERE (Equine Repetitive Elements), concentrando la nostra attenzione sul polimorfismo d'inserzione in relazione alla conservazione della sequenza. Inoltre, con l'obiettivo di studiare se gli elementi ERE possono giocare un ruolo nel modulare l'espressione genica e nell'evoluzione della funzione di alcuni geni, abbiamo ricercato elementi d'inserzione ERE all'interno di introni o nella regione regolatrice al 5' dei geni del cavallo. I risultati preliminari di queste indagini dimostrano che una frazione superiore rispetto all'atteso di elementi ERE si trova all'interno di sequenze introniche, inoltre abbiamo avuto modo di osservare che alcune sequenze ERE sono localizzate nelle immediate vicinanze del promotore di geni espressi.
